WYSYŁKA DZISIAJ !!!

CODZIENNIE W DNI ROBOCZE

WYSTARCZY DO GODZ. 13.00 wysłać do nas:

1) deklarację odbioru przesyłki "za pobraniem"
lub
2) skan przelewu
albo
3) wpłacić za pośrednictwem "Płacę z Allegro"



BIOCHEMIA

Ćwiczenia laboratoryjne

red. Korneliusz Miksch

Stan książki: NOWA
Wydawnictwo: Politechniki Śląskiej 2003
Stron: 116
Okładka: miękka
Nakład: 450 egzemplarzy

Z okładki:

Od ostatniego wydania tego podręcznika minęło prawie 30 lat („Laboratorium podstaw biochemii technicznej", Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, wyd. II, 1980). Wydanie niniejsze, uwzględniające aktualny stan wiedzy w dziedzinie biochemii, przygotowane jest głównie z myślą o studentach specjalności „biotechnologia w ochronie środowiska", „ekotoksykologia i biomonitoring" oraz „inżynieria wody, ścieków i gleby". Dodatkowo, studenci innych specjalności międzywydziałowego hirudina kierunku „biotechnologia" mogą wykorzystywać niniejszy podręcznik do specjalistycznych zajęć laboratoryjnych w ramach innych przedmiotów (np. enzymologii). Mamy nadzieję, że podręcznik będzie przydatny i jednocześnie z życzliwością będziemy przyjmować uwagi, które przyczynią się do jego ulepszenia.

Słowa kluczowe:
• aktywność mikroorganizmów
• białka
• cukry
• dehydrogenazy
• DNA
• enzymy
• fosfatazy

Spis treści:

PRZEDMOWA........................................................................................................................7

ZASADY PRACY W LABORATORIUM............................................................................8

1. WAŻNIEJSZE ZWIĄZKI ORGANICZNE UCZESTNICZĄCE W REAKCJACH BIOCHEMICZNYCH.............................................................................................................9
1.1. Reakcje utleniająco-redukcyjne związków organicznych...............................................9
1.1.1. Reakcja aldehydów z odczynnikiem Schiffa...........................................................9
1.1.2. Utlenianie alkoholi.................................................................................................11
1.1.3. Dismutacja aldehydów...........................................................................................12
1.1.4. Identyfikacja nieznanego alkoholu, aldehydu lub kwasu.......................................13
1.2. Określenie rzędowości amin.........................................................................................13
1.2.1.1-rzędowe aminy alifatyczne..................................................................................14
1.2.2. Il-rzędowe aminy alifatyczne................................................................................14
1.2.3. III-rzędowe aminy alifatyczne...............................................................................15
1.2.4.1-rzędowe aminy aromatyczne...............................................................................15
1.2.5. Aminy alifatyczno-aromatyczne............................................................................17
1.2.6. Określenie rzędowości nieznanej aminy................................................................18

2. AMINOKWASY I BIAŁKA.............................................................................................19
2.1. Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek.......................................................19
2.1.1. Odróżnianie aminokwasów i białek od innych związków organicznych (próba ninhydrynowa).................................................................................................................19
2.1.2. Odróżnianie białek od wolnych aminokwasów (próba biuretowa)........................21
2.1.3. Wykrywanie aminokwasów aromatycznych (próba ksantoproteinowa)................21
2.1.4. Wykrywanie tryptofanu (próba Adamkiewicza-Hopkinsa)...................................22
2.1.5. Wykrywanie tyrozyny (próba Miliona).................................................................22
2.1.6. Wykrywanie aminokwasów zawierających siarkę.................................................23
2.2. Chromatografia bibułowa aminokwasów.....................................................................25
2.3. Ilościowe metody oznaczania aminokwasów...............................................................29
2.3.1. Oznaczanie wolnych grup aminowych metodą formolowego miareczkowania (metoda Sórensena).........................................................................................................29
2.3.2. Metoda ninhydrynowa z zastosowaniem chromatografii bibułowej......................31
2.3.3. Oznaczanie wolnych grup aminowych aminokwasów..........................................31
2.4. Ilościowe metody oznaczania białek............................................................................32
2.4.1. Metoda biuretowa..................................................................................................33
2.4.2. Metoda Lowry'ego.................................................................................................33
2.4.3. Metoda Bradforda..................................................................................................34
2.5. Oznaczanie białka w komórkach mikroorganizmów metodą biuretowa.......................35

3. CUKROWCE.....................................................................................................................38
3.1. Reakcje charakterystyczne cukrowców........................................................................38
3.1.1. Odróżnianie cukrowców od innych związków organicznych (próba Molischa)....38
3.1.2. Wykrywanie wielocukrów (próba Lugola)............................................................39
3.1.3. Odróżnianie cukrów redukujących od nieredukujących (próba Benedicta)...........40
3.1.4. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących (próba Barfoeda).....41
3.1.5. Próba Biała na pentozy..........................................................................................41
3.1.6. Próba Seliwanowa na ketozy.................................................................................41
3.2. Identyfikacja cukrowców metodą mikroskopową........................................................44
3.3. Mutarotacja cukrów......................................................................................................46
3.3.1. Pomiar szybkości mutarotacji glukozy..................................................................47
3.3.2. Wpływ alkalizacji środowiska na szybkość mutarotacji glukozy..........................47
3.3.3. Przyspieszenie mutarotacji hirudina glukozy za pomocąjonów Zn .................................48
3.4. Oznaczanie węglowodanów w komórkach mikroorganizmów metodą antronową......48

4. TŁUSZCZOWCE..............................................................................................................52
4.1. Własności tłuszczów.....................................................................................................54
4.1.1. Zmydlanie tłuszczów.............................................................................................55
4.1.2. Otrzymanie mydła nierozpuszczalnego.................................................................56
4.1.3. Wysalanie mydła...................................................................................................56
4.1.4. Wydzielenie wolnych kwasów tłuszczowych........................................................56
4.1.5. Wykrywanie glicerolu za pomocą próby akroleinowej..........................................57
4.1.6. Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych..............................................57
4.1.7. Badanie świeżości tłuszczu....................................................................................58
4.2. Wyznaczanie liczb tłuszczowych.................................................................................59
4.2.1. Liczba kwasowa (LK)............................................................................................59
4.2.2. Liczba zmydlania (LZ)..........................................................................................60
4.2.3. Liczba jodowa (LJ)................................................................................................61

5. KWASY NUKLEINOWE.................................................................................................64
5.1. Wykrywanie składników kwasów nukleinowych.........................................................64
5.1.1. Otrzymywanie kwasów nukleinowych z drożdży..................................................64
5.1.2. Hydroliza kwasów nukleinowych..........................................................................65
5.1.3. Wykrywanie cukrowców.......................................................................................65
5.1.4. Wykrywanie kwasu fosforowego..........................................................................65
5.1.5. Wykrywanie zasad purynowych............................................................................66
5.2. Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych...............................................................67
5.2.1. Oznaczanie RNA metodą orcynolową...................................................................68
5.2.2. Oznaczanie DNA metodą dwufenyloaminową......................................................69
5.3. Oznaczanie DNA w komórkach mikroorganizmów.....................................................69

6. KATALIZA ENZYMATYCZNA....................................................................................72
6.1. Oksydoreduktazy..........................................................................................................72
6.1.1. Dehydrogenaza kwasu mlekowego - LDH............................................................72
6.1.2. Oksydazy...............................................................................................................74
6.1.3. Katalaza.................................................................................................................75
6.1.4. Peroksydaza...........................................................................................................76
6.2. Hydrolazy.....................................................................................................................78
6.2.1. Hydrolazy glikozydowe.........................................................................................78
6.2.2. Ureaza....................................................................................................................80
6.3. Oznaczanie aktywności fosfataz w komórkach mikroorganizmów..............................81
6.4. Wyznaczanie energii aktywacji....................................................................................83
6.4.1. Wyznaczanie energii aktywacji reakcji enzymatycznej hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę........................................................................................84
6.4.2. Wyznaczanie energii aktywacji utleniania sacharozy przez mikroorganizmy osadu czynnego..........................................................................................................................85

7. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH...........................................................87
7.1. Oznaczanie stężenia sacharozy metodą polarymetryczną.............................................89
7.2. Wyznaczanie parametrów kinetyki reakcji chemicznej................................................89
7.3. Wyznaczanie parametrów kinetyki reakcji enzymatycznej..........................................93
7.4. Wpływ stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy..........................................95
7.5. Wpływ odczynu na szybkość hydrolizy sacharozy.......................................................96
7.6. Wyznaczanie kinetyki procesów enzymatycznych przez pomiar szybkości zużycia tlenu przez mikroorganizmy (aktywność oddechowa)........................................................97

8. POMIAR AKTYWNOŚCI DROBNOUSTROJÓW......................................................99
8.1. Określenie aktywności drobnoustrojów za pomocą pomiarów poboru tlenu................99
8.2. Określanie aktywności drobnoustrojów za pomocą sztucznych akceptorów elektronów.........................................................................................................................100
8.2.1. Wyznaczanie optymalnego stężenia chlorku 2,3,5 —trój feny lo-tetrazolowego podczas oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC...........................101
8.2.2. Wyznaczanie zakresu wprost proporcjonalnego przyrostu trójfenyloformazanu podczas oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC...........................102
8.2.3. Wpływ warunków tlenowych na wynik testu TTC..............................................103
8.3. Wyznaczanie toksyczności za pomocą testu TTC......................................................104
8.4. Porównanie aktywności dehydrogenaz wyznaczonej metodą testu TTC i testu INT.. 105
8.5. Wyznaczanie toksyczności za pomocą pomiarów aktywności oddechowej...............108

BIBLIOGRAFIA.................................................................................................................111
ODCZYNNIKI SPECJALNE.............................................................................................112
ORIENTACYJNY CZAS WYKONYWANIA DOŚWIADCZEŃ..................................114